もうすぐ動画「酵素の旅」ができるかも

先日の２つ前の記事では、超高磁場 NMR を使うと、いわゆるスペクトルにおける分解能と感度が上がる（静的な分解能と感度の上昇）だけでなく、CPMG 実験などダイナミクスの観測においても分解能と感度が上がる（動的な分解能と感度の上昇）ことを書きました。静的な方はイメージとして掴みやすいのですが、これだけですと X-ray 結晶構造解析でよいではないかという議論になってしまいます。しかし、超高磁場 NMR における静的な特徴はそのまま動的な特徴にもつながりますので、むしろ NMR で得意とする動的（ダイナミクス）観測においても、分解能と感度が上昇するという点が重要です。

ある方から下記の出来立てほやほやの論文を紹介していただきました。なるほど読んでみると大変面白かったので、是非一読をお勧めいたします。

Oyen D., Fenwick R.B., Aoto P.C., Stanfield R.L., Wilson I.A., Dyson H.J., and Wright P.E. (2017) Defining the structural basis for allosteric product release from E. coli dihydrofolate reductase using NMR relaxation dispersion. J. Am. Chem. Soc. 139 (32), 11233–11240. doi: 10.1021/jacs.7b05958.

DHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）の遷移状態での構造を NMR の CPMG 実験を通して解析しています。遷移状態のモル比は非常に小さい（数パーセント程度）ですので、結晶もなかなか出ませんし、また NMR の二次元スペクトルでも現れてきません。

しかし、基底状態で CPMG 実験を行うと、基底状態と遷移状態の間の交換現象を観ることができ、さらにデータに理論式などをフィティングすることにより「遷移状態での二次元スペクトル」を（もちろん完璧にではないですが）予測することもできます。実際は見ることのできない架空の遷移状態でのスペクトルを CPMG では見積もれる点がたいへん強力です。

さらに、これまではアミド基の 15N の CPMG がよく利用されていたのですが、今回はメチル基の 1H の CPMG が観測されています。これは高分子での感度を上げるためです。特に今回の補酵素 NADP+ や生成物 THF は芳香環を含んでいます。芳香環にはπ電子が回っていますので、その近くにある 1H の化学シフト値がπ電子に強く影響されます（環電流効果）。その結果、NADP+ や THF の向きが変わると、その近くにある 1H の化学シフト値が大きく変わり、しいては CPMG にも大きな変化となって現れてきます。基底状態と遷移状態とでは、NADPH, THF の向きが変わっており、これが最終生成物である THF が効率よく酵素から放出される仕組みであることが、今回の実験から分かりました。

DHFR: THF: NADPH 複合体が不安定であるため、結晶構造解析が成功しなかったようです（NADPH がすぐに酸化してしまうため）。NADPH の代わりに酸化型の NADP+ で、かつ、生成物 THF の代わりに安定化アナログ ddTHF で複合体の結晶は解析されていますが、NMR の化学シフト値を解析してみると、結晶内での ddTHF 部分の構造は歪められてしまっていたことが分かったようです。創薬ではこのようなアーティファクトに気を付けないといけないですね。そこで、実際の遷移状態の構造を解析するために、NMR の CPMG 実験が利用されました。

図１の３つのモデル図に対応しています。

構造１：occluded（閉鎖）型 基底状態 DHFR: THF: NADPH 複合体
構造２：closed 型 遷移状態 DHFR: THF: NADPH 複合体（小さいモル比のため「見えない」はずの構造を「観た」のが今回の実験の成果）
構造３：closed 型 基底状態 DHFR: NADPH 複合体

以前の 1H/15N-CPMG 実験から、構造１と構造２の間で交換が起こっていることまでは分かりました。しかし、メチル基の 1H は近くにある芳香環の環電流効果の影響を受けやすく、構造変化に対して非常に敏感ですので、メチル基の 1H の CPMG が測られました。メチル基の 13C の CPMG を測定してもよいと思いますが、論文によると、試料が不安定なため短時間で測定を終えなければならず、メチル基の 1H だけしか十分な感度に達しなかったと書かれています。

そして（構造１と構造３それぞれの二次元スペクトルの化学シフト値の差）=（メチル基 1H の CPMG 実験から見積もられた構造１と構造２の化学シフト値の差）という結果になりました。

ここで、遷移構造である構造２はモル比も小さいので、NMR で直接二次元スペクトルを観ることができません。また、結晶構造もありません。しかし、CPMG 実験から「もし遷移構造２のスペクトルが観えたとすれば、きっと取るであろう化学シフト値」を見積もることができます。

以上の結果から、構造２と構造３は非常に似ていることが分かりました。つまり、両方とも NADPH のニコチンアミド部分が活性部位の cavity に入り込んでいます。さらに、構造２では、ニコチンアミド部分の瞬間的な侵入により THF のプテリン環が押し出されています。このようなアロステリック効果により、THF が効率よく放出されて酵素反応が終了して回転 turn-over することを見つけました（THF が勝手に離れていく現象もありますが、これはもっと遅い）。

試料調製の項をみると、酸素による酸化を避けるためにアルゴンガスの中で調製しています。同じ溶液内に NADPH を還元状態にできるだけ保つための酵素系も入れてあります。NADP+ のニコチンアミド部分は周りの 1H に環電流効果を及ぼしますが、NADPH のニコチンアミド部分は二重結合はあるものの環電流効果をもちませんので、周りの 1H の化学シフトにはそれほど大きな変化を与えません。そのような違いから、NADPH が酸化していないかどうかを判定したそうです。そのような試料調製の困難さも高い評価に繋がっているように思います。

それにしてもお見事な英文ですね。最近は L. E. Kay さんの文章をお手本にしていますが、今回も流れるようなほれぼれした文章で、ちょっと酔ってしまいました。

NUS んでよかった。

「あーーっ、また地震 .... 。」環太平洋は地震ばかり。

せっかく気合を入れて測定している HNCOCACB-trosy が台無しです。次の測定時間が来るまで帰属作業もおあずけ。と落胆していたのですが「待てよ、これは NUS（non-uniform sampling）で測定していたんだ！」ということを思い出しました。そこで測定をそのまま続け、先ほど測定が無事に？終わりました。下が３日分の FID 信号を左から右に並べた図です。

変な FID が一つ混じっています。これを拡大すると、振幅が他のに比べて異常に大きいことが分かります。フーリエ変換すると、やはり水のピークでした。

地震でシムがむちゃくちゃになり、水 1H の周波数がブロードになり、水選択パルスの効率が落ちて FID に水の信号が乗ってしまったのです。しかし、NUS ならば、この FID と周辺だけを除くと問題ないはずです。今からそれを試してみようと思います。

まず問題の FID の番号が 2519 であることが分かりました。#2518 と #2520 は問題ないようです。ところが、15N と 13Cab の両方を real と imaginary で測定していますので（厳密には TROSY ですので、15N 軸はそうではありませんが）、#2519 を含む４つの FID をいっしょにセットで除かないといけません。すると、#2517 から #2520 の一連の FID がそれに相当することになります。また、NUS の番号では 2520/4=630 になりますので、NUS-list の 630 行目を消さないといけません。というわけで早速 Perl で４つの FID を除くプログラムを書きます。もう Perl を使っている人なんていませんね。皆 Python 一色です（駱駝の化石です。でも生きている蛇は苦手。若手の人には意味不明かも）。念のため最初は４つの FID 部分に zero を入れて、本当に目当ての箇所のデータを書き直しているかをチェック。結果、バグっていました。歳をとるとこれしきのプログラムですら間違えてしまいます。情けない。書き直して再挑戦。今度は大丈夫でした。後は fid.com の NUS の数値を誤魔化して go です。ついでに Smile も。

HNCACB-trosy と HNCOCACB-trosy を並べてみました。前回は、重水素デカップリングがうまくいかず何度も試しているうちに試料に凝集が起きたりして、HNCOCACB では１割以下の数しかピークが出ませんでした（しかも N-, C-末端部分のみ）。今回は期待できそうです。

HNCACB のとあるピークと HNCOCACB のとあるピークが同じ化学シフトにあるように見えます。これは HNCACB では 1H(i), 15N(i), 13Cab(i-1) の共鳴もついでに見えるためです。しかし、よく見ると、ほんの少しですがずれている場合があります。これは、13Cab(i-1) と13Cab(i) の共鳴値がほとんど同じであるために起こります。図の縦線が引かれている箇所の 13Ca ピークをご覧ください。この蛋白質にはこのようなケースがたくさん見られ、これをさっと見分けるには数年の経験を要するかもしれません。しかし、この程度でもずれていたらそれは重なっているピークなのだということさえ認識できれば、問題ないと思います。若手のみなさん、AI に負けないように頑張りましょう。

重水素デカップリングの問題も NUS の導入からは全く出ていません（この前の記事をご参照ください）。NMRPipe による NUS-IST もお見事です。Smile は線形はよいのですが、それゆえスペクトルは時間データに忠実な感度になるようです（NOESY 向きか？）。一方、IST は魔法がかかって騙されたかのようにシャープな感度のよいピークをプレゼントしてきます（その分、線形が崩れることもありますが、今は質より量が大事）。よって、とにかく帰属ができるかできないかのぎりぎり路線で戦っている（塵であってもピークかもしれないという可能性に賭けて拾っている）今の状況では、とても有難い存在です。

ところで、今更なのですが（real time で書いていたため）。
上記のように、地震が起きた時の FID データをせっせと除いたのですが、除かないでプロセスしたデータと試しに見比べてみた結果、ほとんど違いはありませんでした。お笑いです。時間軸データにおいてある点だけが局所的に変になったとしても、それをフーリエ変換などで周波数軸スペクトルに転換すると、被害が散らばってしまいます（局所的←→全体的）。ほんの少しだけスペクトルのノイズが多くなったのかもしれませんが、と思い込んでおきましょう。

1,200,000,000 Hz 磁石

論文ではないのですが、下記のニュースが先日伝えられました。

Schwalbe, H. (2017) New 1.2 GHz NMR spectrometers- new horizons? Angew. Chem. Int. Ed. Engl. doi: 10.1002/anie.201705936.

超高磁場 1.2 GHz NMR の磁石は、地磁気の 50 万倍（28.2 テスラ）のお大きさとなります。まずこの静磁場の大きさに驚きですが、単に大きいだけではダメでして、試料が入るサイコロほどの空間のどこを測っても静磁場強度が同じでないといけません。この均一性の誤差は 99.999....% 以内（書き間違えますので、"9" が 10 個も並ぶ精度だと覚えておくことにしましょう）。

超電導技術もこれまでとはちょっと違うそうです。これまではコイルの材質にニオブスズ (Nb3Sn) を使っていました。しかし、超電導は自分で作った磁場に弱いという悲しい性質がありまして、1.2 GHz レベルになると自滅してしまいます。そこで、イットリウム・バリウム・銅酸化物のようなレアメタルの合金も同時に（ハイブリッドとして）使うそうです。しかし、上記のような均一な磁場を作るのは技術的にたいへん難しいとのことです。

それで数年前までちょっと無理とも言われていたのですが、どうもこの記事によると、2017 年中に 1.1 GHz を、そして来年 2018 年には 1.2 GHz を納めると書いています。文章をそのまま載せますと、Bruker plans to deliver the first 1.2 GHz magnets next year. 「magnets」と複数形になっています。すでにフィレンツェ、フランクフルト、ゲッティンゲン、ユーリッヒ、リール、ミュンヘン、ユトレヒトが発注済みとのことです。それぞれのラボの先生の顔が浮かんできます。それにしても、何故ヨーロッパだけこれほど進んでいるのでしょう？

なぜ大きな磁石の方がよいのかという点を説明するのは大変です。もちろん最大の理由は感度が上がるため、そして、分解能も上がるためです。すると、薄い濃度の試料でも、ピークが全て解れて観えるということになるのですが、これは静的な状態での話です。

NMR はそこで終わるともったいなく、実際には動的な状態での「分解能」と「感度」もアップすることにも注目しないといけません。「動的な」とはまさに「ダイナミクス」を観ようとしている場合のことです。昔は蛋白質は固定されたある一つの形を保っているものと仮定して、その一つの形を解いてきました。しかし、この考え方だけでは「ただ単にある安定な構造を決めただけ」となり、その後が続きません。構造はいつも動いていて、酵素などが機能を発揮するときには遷移構造に移ります。しかし、この遷移構造にははかなくも一瞬の寿命しかなく、この構造をじっくり「静的に」解こうというわけにはいきません（遷移状態を模倣したアナログ基質を入れた実験、NMR-CPMG 動的実験、自由電子レーザ実験などにより可能）。ということは複数の構造が高速で入れ替わっているような混ぜ混ぜ回転状態を観察しないと、生命機能や最先端創薬に迫ることが難しい時代になってきたのです。

これを交換状態と呼びますが、NMR で交換状態を観測した時、静磁場が大きい程より分かれた形での情報を得ることができます（ダイナミクスの分解能が上がる）。もし NMR の教科書をお持ちであれば、slow-exchange などの項目を読んでみてください。小さい磁場では一本に観えるピークでも、高磁場で測ると２本に観えると、よく説明されています。NMR のダイナミクスの実験は CPMG などなかなか理解するのが難しいのですが、基本的にはこの２本と１本のピークの話に集約させることができます。たとえ slow-exchange とみなせないほど速い fast-exchange の系であっても、その検出感度は静磁場の２乗に比例してアップします。このような fast-, intermediate-, slow-exchange の関係があるので高磁場の方がよいのですよと NMR の専門外の方に説明するのは、私のプレゼン技量ではちょっと無理かもしれません。まとめると「静的状態ばかりでなく動的状態においても感度と分解能が上がる」と言えます。

さらに、細胞内の蛋白質をそのまま観たりなど、観測したい蛋白質の周りの環境も、これまでのちゃんと精製されたきれいな緩衝液ではなく、実際の細胞、血液のような何が入っているのか分からないような混ぜ混ぜ状態になってきました。このようなヘテロな系を観るには「分解能」と「感度」が、成功するか失敗するかの境界線を決める要素になってくるのです。

では「分解能」の次に「感度」の話に移りましょう。ここで測定時間について考えると面白いことが分かります。よく「感度が２倍に上がった」などと言いますが、この場合、測定時間は 1/4 でよいことを意味します。感度は静磁場強度の 3/2 乗に比例しますので、これを測定時間に換算すると、静磁場強度が上がるごとに極端に短い測定時間で済ませられることになります。日頃このような事をあまり意識しないので（というより、大きな NMR にはさらに難しい試料をこれでもかと突っ込んでしまうので）これを証明するようなデータをとっていませんでした。しかし、あらためて考えなおすと 600 MHz を 1.2 GHz に変えた（買えた、替えた？）場合、８時間かかる実験が１時間でよいことになります。本当は昔のようにもっとのんびりと測りたいものです。しかし、それは世界中皆が同じスピードの時にはよいものの、８倍はやくデータを出してくるようなグループが地球の裏側に一杯いるような状況になると、やはり焦ってしまうものです（悲しいかな２番手には何も残りませんので）。

いまフーリエ変換待ちのデータが山ほどあることに気づきました。フーリエ変換そのものではなく、NUS プロセスなのでちょっとややこしいのです。明朝にはまた次のデータが入ってくるので、今年もお盆なしです。