蛋白質どうしの切り貼りが簡単に

溶け難い蛋白質をどのようにして無理矢理にでも溶かすか？一つの方法として、良く溶けることがすでに分かっている蛋白質と融合させてしまう、つまり、fusion-protein として発現させてしまうという方法があります。例えば、よく使われる GST-tag などは、もちろん affinity-カラムを使って効率良く精製するためが主な目的なのですが、GST そのものが良く溶ける蛋白質であるため、その後ろ（あるいは前）に繋がっている目的の蛋白質もつられて溶けてしまうという性質をもたぶんに活用してもいます。ですので、精製がある程度進んだ段階で、GST と目的の蛋白質をプロテアーゼで切り離すと、途端に目的の蛋白質が沈殿してしまったなどという事は頻繁に起こります。

では、もう切り離すのは止めて、その fusion のままで NMR を測定してみては？ということになります。ところが、大腸菌などで fusion-protein を発現させると、目的の蛋白質だけでなく、タグ側の GST も 15N (13C) で標識されてしまい、NMR スペクトルは両者のピークが混在するという悲惨な状況になってしまいます。

これを防ぐには、GST-カラムのレジンに GST 部分だけをくっ付けたままで NMR を測定するという方法があります。あれ？その論文は何処に行ったのだろう？ちょっと探してみたのですが、見つからなかったので、同じ著者の関連論文を挙げておきます。

Hayashi, K. and Kojima, C. (2010) Efficient protein production method for NMR using soluble protein tags with cold shock expression vector. J. Biomol. NMR 48, 147-155.

レジンにくっ付いた GST は超高分子量になってしまいますので、ピークがブロード化し過ぎて見えなくなってしまいます。一方、その後ろに繋がっている目的の蛋白質は、長いひもで繋がれた子犬のように、あちこちを泳ぎ回るので、ピークが見えるというしくみです。

しかし、もし、GST などのタグ蛋白質部分だけが非標識で、目的の蛋白質部分だけが 15N, 13C で標識されていたら、これほど嬉しい事はないわけですが、それが何と可能となりました。

Kobashigawa, Y., Kumeta, H., Ogura, K., and Inagaki, F. (2009) Attachment of an NMR-invisible solubility enhancement tag using a sortase-mediated protein ligation method. J. Biomol. NMR 43, 145-150.

タグはタグだけで非標識の培地で発現させます。一方、目的の蛋白質は 15N/13C の入った M9 最少培地で発現させます。そして、それらを後で融合させるのです。

蛋白質どうしの融合という方法には何通りかありますが、有名なのが「インテイン」を使った方法です。

Otomo, T. Ito, N., Kyogoku, Y., Yamazaki, T. (1999) NMR observation of selected segments in a larger protein:  central-segment isotope labeling through intein-mediated ligation. Biochemistry 38, 16040–16044.

1999 年の発表ですか。。。時の経つのは速いものですね。

邦文の総説を見つけました。

湊雄一, 上田卓見, 町山麻子, 嶋田一夫, 岩井秀夫.「区分標識法によるマルチドメイン蛋白質の NMR 解析」日本核磁気共鳴学会誌 Vol. 3, pp. 11-18.

ヘルシンキ大学の岩井先生の総説ですね。うれしい事に one-click で本一冊まるごとがダウンロードされてしまいました。。。

しかし、この方法では、蛋白質を一度 unfold させないといけないので、refolding が可能な（いわば頑丈な）蛋白質にしか適用できないという欠点があります。ところが、上の Kobashigawa, Y. et al. の方法は、sortase （ソルターゼ：グラム陽性菌でペプチドグリカンを作るのを触媒するトランスペプチダーゼだそうです）を使って、一種の切り貼りをしてしまおうというわけです。たいへん面白いですね。

著者らは、さらにいろいろな工夫を凝らして効率を上げています。例えば、ソルターゼは酵素ですので、逆反応も触媒してしまうわけです。つまり、「切り」と逆の「貼り」の両方を同時に進めてしまう。これでは、行ったり来たりで前進０です。そこで、tag と目的の蛋白質を融合させる際に出てくる（何と表現すれば良いのでしょう）切り代（しろ）？をせっせと取り除き、逆反応が進まなくなるように工夫しています。切り代は小さいですので、透析で除くのです（つまり、何もせずに放っておくだけで良い）。

その他の詳細は Kobashigawa, Y. et al. に載っておりますので、是非読んでみてください。また近々「生物物理学会誌」にも総説が載るとの噂です。