蛋白質にも引っ掛かりが

蛋白質と摩擦 .... 何とも聞き慣れない用語の組み合わせが、下の論文に載っていました。

Sekhar, A., Vallurupalli, P., and Kay, L.E. (2012) Folding of the four-helix bundle FF domain from a compact on-pathway intermediate state is governed predominantly by water motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 109 (47), 19268-19273.

この論文のキーワードは friction です。これ「摩擦」と訳して良いのかな？もしかして「抵抗」だったら、どうも申し訳ないです。この「摩擦」の原因は大きく二つに分けられています。一つは、周りの溶媒である水のブラウン運動（溶媒摩擦）、もう一つは、蛋白質の原子自身の動き fluctuation（分子内摩擦）です。両者ともに蛋白質が解けた状態からちゃんと折り畳まれた状態に移る時に folding を邪魔します（ですので、摩擦 or 抵抗なのですね）。しかし、同時に unfold と fold の間を遮るエネルギーの障壁を越えるのにも働いてきます。「摩擦が折り畳みの駆動力にもなる？」何だかピンと来ないですね。

まず前者の溶媒摩擦についてですが、これはまさに粘性（η）と考えてよいようです。一方、分子内摩擦（σ）は、主鎖や側鎖の二面角が動く時の一種の抵抗（障壁？）などに起因するそうです。これら溶媒分子や蛋白質原子のランダムな運動がそれぞれ溶媒摩擦と分子内摩擦を生み出し、蛋白質の構造交換のスピードを落とすわけですが、同時にこのランダム運動が unfold と fold 状態の間の活性化エネルギーの壁を飛び越える原動力にもなるそうです。確かに各原子がその場にじっと止まったままでは、unfold は unfold のまま、fold は fold のままですね。原子がいろいろな方向にでたらめに動いている内に unfold と fold の間の壁を偶然に乗り越えてしまうということも起こるのでしょう。では、溶媒分子と蛋白質原子のどちらのランダム揺れの影響が強いのか？この論文に載っている結果では、溶媒摩擦が 1 cP（センチポアズ）程度であるのに対して、分子内摩擦は 0.3 cP ぐらいであり、分子内摩擦が予想に反して小さいとの事でした（ちなみにマヨネーズは 8,000 cP なので、原材料の生卵のリゾチームの主鎖・側鎖の原子は超ゆっくりと動いてているのでしょうか？）。

しかし、摩擦は抵抗ですので、大局的に見ると、溶媒摩擦である粘度（η）と分子内摩擦（σ）は、unfold と fold の間を行き来する交換の速度を遅くしてしまいます。この論文では unfold というより folding への中間状態の構造（intermediate）と完全に fold した構造（native）の間の交換速度を測っています。この交換速度定数を k(IN) と k(NI) と表すことにしましょう。それぞれ、I 状態から N 状態への交換速度定数、N 状態から I 状態への交換速度定数を示します。そして、この速度定数 k は、溶媒摩擦（粘度）と分子内摩擦の和（η+σ）に反比例します。また k の逆数は寿命時間ですので、寿命時間は（η+σ）に比例すると考えてもよいようです。

ここで、I 状態の数（p(I)）は全体の数% 以下しかない場合が多いですので、I 状態の HSQC などは直接観ることができません。しかし、NMR の CPMG 法を使うと、k(IN) , k(NI), p(I), p(N) などを決めることができます。さらに、CPMG 実験では、I と N 状態の間の化学シフトの差（残念ながら、絶対値なのですが）が求まりますので、頑張れば I 状態の HSQC を「計算で予測する」こともできるわけです（すごいです！）。

著者らは、いろいろな粘度（0.9 ~ 2.2 cP）でこの CPMG 実験を行いました。粘度を上げるためにグリセロールや BSA を溶液に加えていますが、それらが I, N いずれの立体構造をも変えていないことを化学シフトが同じであることから証明しています。さらに粘度が変わっても p(I) は変わりませんでした。これらが結果を導くための前提条件となります。つまり、グリセロールなどの viscogen（粘性分子？何と訳しましょう？）は、単純に溶媒の粘度だけを変えるのです（ただし、I と N の間にある遷移状態 TS の構造に影響を与えるかどうかについては後ほど）。

では、溶媒摩擦が I から N への構造交換にどのように関わって来るのでしょうか？ここでの I 構造は完全に解けた構造ではなく、そこそこ fold しています。しかし、もちろん Native 構造とは少し異なります。そこで、この I から N へ移行するためには、一旦 I での分子内相互作用が壊れ、かなり伸びた遷移状態 TS 構造を経て、最終的に N 構造に移る必要があります。TS の伸びたポリペプチド鎖が溶媒の中を進まないといけませんので、粘度が高いとそのスピードがゆっくりとなってしまうわけです。さらに、I や N では、かなりの数の水素結合は（もちろん I と N とで、組み合わせペアが異なるのですが）分子内で組まれています。ところが、TS ではそれらの基が溶媒に露出するため、溶媒と水素結合を組みます。このような水素結合の組み換えが起こる時、溶媒の粘性が影響してきます。

なお、グリセロールや BSA などの viscogen は I, N, TS 構造のいずれとも相互作用していません（単純に溶媒の粘性だけを上げている）。もし、I, N にくっ付いてその構造を変えてしまうと、それら 1H-15N の化学シフト値も変わってしまうはずです。さらに p(I), p(N) も変わりますが、そのようになってしまったデータはこの論文ではちゃんと捨てられています。また、著者らの実験では TS 構造にもくっついていないとされています。

Viscogen が TS 構造を不安定化させ、活性化エネルギーを上げたと仮定しても、k(IN), k(NI) は同じように遅くなります。そして、その比である p(I), p(N) は変化しません（p(I)*k(IN) = p(N)*k(NI), この遷移構造を逆に安定化して活性化エネルギーを下げるのが一般的な触媒の働きです。触媒は両方向の反応速度を速めますが、基質と生成物の平衡状態でのモル比を変えるものではありません）。著者らはグリセロールと BSA という異なる種類の viscogen を使った時の結果を比べ、両者の分子内摩擦（σ）がほとんど同じだったことから、これら viscogen は TS 構造を不安定化させていないと判断しました。もし、不安定化せさているのであれば、グリセロールと BSA ではその程度が異なり、ひいては分子内摩擦の値（σ）も違ってくるためです（I → TS → N と移るので、TS に viscogen がくっ付いて不安定になると（活性化エネルギーが上がると）、I → TS が進みにくくなり、分子内摩擦が上がったように見える）。

水和水を含め、昔から水が蛋白質の構造形成に重要であることは知られていました。例えば、分子内や分子間の疎水的相互作用の内、エントロピー項として効いてくるのは溶媒分子によるものです。ちなみに、エンタルピー項は van-der-Waals 力です。しかし、細かい数値的にはなかなか一致した結果が出ていないような気がします。今回の研究結果についても FF-domain だけでなく、もっと多くの蛋白質で調べないとはっきりとした事は言えないでしょう。しかし、R2-dispersion 法（緩和分散法）がこのような物性をも調べる方法の一つになるとは驚きでした。ちょっと専門外の内容でしたので、正しく読めているかどうかの自信はありませんが、実際に論文を読まれる際の理解の一助になるとうれしいです。またまた図が皆無ですが、原著論文の figure を是非参考にしてください（特に Fig. 4B）。

にぬきはできるだけ避けたい その２

なんと前回の内容にコメントが２件も寄せられました（ご覧になられているのが "Blogger" 側の設定でしたら、コメントと書かれた箇所をクリックしないと、このコメントの内容が見られないようになっている場合がありますので、ご注意ください）。このコメント内容に全く賛成です（おかげさまで、今日書くべき内容が無くなってしまいました ..... ）。どうもありがとうございました。

確かに DTT の酸化（劣化）は、温度が高いと速いように思います。そこで、NMR 試料に加える重水素化 DTT などは、1 M ストックを 10 uL ずつぐらいに分注して冷凍しておきます。目的の蛋白質試料が 300 uL あるとすると、そこに重水素化 DTT を 3 uL 入れると、DTT の濃度が 10 mM の濃度になりますね。

同じ方から、TCEP の方が酸化しにくいという情報も頂きました。なるほど、Wikipedia には DTT や β-メルカプトエタノールより良さそうと書かれています。今度使ってみましょう。重水素化 TCEP はあるのかな？

それにしても、100 アミノ酸程度の DNA の合成の費用が 25,000 円とは驚きです。2,000 年頃でしたか、.... 知り合いの人から 200 アミノ酸ぐらいの DNA の合成で百万円以上かかったと聞いたことがあります。確か human からサブクローニングした cDNA でしたので、発現が悪く悪戦苦闘していたようです。レアコドンの tRNA を供給するようなタイプの大腸菌を用いても、あまり効果が上がらなかったそうな。そこで、思い切って DNA の全合成をしました。その時に、もちろん大腸菌のコドン使用頻度（codon-usage）に最適化して合成しました。すると、今度は発現し過ぎて困るという事態に。。。培養の時に温度を下げたり、誘導物質の IPTG をちょっとにしたりして、なんとか発現し過ぎを抑えたそうです。あまり慌てて発現させると、folding が追い付かないのか、せっかく発現した蛋白質が封入体（inclusion-body）に行ってしまうのですね。

その時に Cys を Ser に替えて DNA を合成しておけば良かったのですが、すでに出ていた結晶構造を見る限り Cys は中に埋もれているので大丈夫だろうとの憶測で、Cys のまま　DNA を合成しました。すると、調製した直後は NMR ピークがなんとか観えているのですが、１日経ち、２日経ち、... とどんどんピークが消えて行くのです。結局、主鎖の帰属用の３次元スペクトルをとると、全体の半分ぐらいしかピークが現れず、５年間かけても帰属が半分強までしか達成できませんでした。当時としては世界最高記録の 1H 感度の機械で測定したのですが。。。

結局、その試料は当分の間忘れ去られることになったのですが、ある時、蛋白質試料の安定化を研究している人からテスト用に使いたいという申し出があり、お渡しすることになりました。真っ先に行ったことは Cys から Ser への置換だそうです。すると、どうした事でしょう。それまで観えなかったピークがわさわさと、土筆（雨後の筍？）のように生えてきたではないですか！しかも、１年放っておいても同じ！結局８年目にしてほぼ 100% の帰属が達成されましたが、もっと早く Ser への置換体を作っておけば創薬 NMR 関連でちょっとした成果が出せたかもしれず、悔やまれます。

この結果は Cys が構造の中の方に埋まっていても油断はできないということを示しています。蛋白質は時々ガバッと開いては閉じるといった breathing-motion（呼吸運度？）を伴っていると言われています。その時に一瞬ですが Cys が露出してしまうのかもしれません。もし、運悪くすぐ隣に同じように開いた蛋白質分子がいると、それと disulfide-bond を作ってしまうのでしょう。こうして出来た二量体では、その disulfide-bond が中に埋もれてしまい、なかなか DTT などの還元剤が近付くことができません。そのため、disulfide-bond が還元されて切れるよりかは、新たに形成されていく方が優勢になってしまい、さらに下手をすると、どんどん凝集が進んで多量体へと変貌してしまうのかもしれません。

このような酸化還元反応は本来は可逆のはずですので、原理的には新鮮な DTT を大量に入れておけば大丈夫のはずです。ところが「にぬき」はどんなに頑張っても「生卵」に戻せないのと同じように、disulfide-bond そのものが中に埋もれて、そこに還元剤が辿り着けないような状況になってしまうと、事実上「不可逆」になってしまいます。

それにしても、コメント２のコメント「また、最初から蛋白質内のシステインを無くしておけば、のちのち DOTA やら CPP やらを導入しては楽しむ、のが簡単になります」→ このような実験を「楽しめる！」人となると、誰？思い付く人数が限られてきてしまう ... 。

DOTA：1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸

CPP：膜透過性ペプチド（cell-penetrating peptide）

N2 ガスを満たした袋に NMR 試料管を入れて冷蔵庫に入れておく。→ これ名案ですね！

にぬきはできるだけ避けたい その１

このブログの来場者数を眺めてみると、どうも NMR のスピン系について書いたページは訪問者が悲しいまでに少なく、試料に関する事を書いたページは多いようです。なるほど確かにこれだけ図も少なく、しかもテキストモードの数式では読むのもしんどいことでしょう。まだ前々回のグラジエントの続きを書かないと駄目なのですが、ここで少し NMR の試料調製について幾つか連載したいと思います。

ただし、蛋白質試料を基にした試料調製であり、多くが単なる筆者達？の経験に基づいて頑なに？信じている内容ですので、「本当は違うことが証明されている！」なんて事も多々含まれてしまっているかもしれません。

まず最初は、「蛋白質にシステイン（Cys）が含まれていたら？」についてです。蛋白質が折り畳まれる（folding）時には、疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合、水和などが主な駆動力になっているわけですが、これらはきっちりとした化学結合ではありません（水素結合については、J-coupling が存在しますので、半ば結合とも言えますが）。ところが、システインどうしのジスルフィド結合（disulfild-bond）については、完全な化学結合と言えます。Cys の側鎖を Ca-Cb-Sg-Hg で表しますと、二つのシステインの頭どうしが結合して Ca-Cb-Sg-Sg-Cb-Ca となるのです。これが分子内の二つの Cys どうしで掛かっている場合にはさほどの問題ではありません。むしろ、実際にそのように結合があり、folding の大きな助けになっているのでしょう。

ところが、このジスルフィド結合が、ある分子と別の分子の間（つまり、分子内ではなく分子間）で意図せずに掛かると厄介です。単量体どうしの間に赤い糸ができて二量体となってしまいます。もし、分子の中にたくさんの Cys があると、別の Cys がまた別の分子の Cys と結ばれてといった状況で、まるで数珠繋ぎにほとんど無限に連結されてしまいます。これはまさに「にぬき」の状態です（おいしいですね。海の塩を振り掛けたにぬきは大好物です）。

このいわば非特異的な希望しないジスルフィド結合の形成を防ぐには、試料の中に還元剤を入れておきます。例えばジチオスレイトール（DTT）などです（th の発音をタ行で書けば、ディティオトゥレイトール）。しかし、たとえ 10 mM 程度入れておいても、これどのぐらい保つのでしょう？この DTT は酸素と触れると自らが酸化されてしまい、もう還元力は無くなってしまいます。したがって、NMR 試料管にできるだけ空気を入れないようにしないといけません。しかし、キャップを閉めようが、パラフィルムを巻こうが大して効果はありません。その証拠に NMR 試料管の中にクロロホルムを入れ、自分で納得の行くまでキャップやパラフィルムで閉管し、ドラフトの中に置いておいてください。翌朝どれだけ蒸発して減っていることか？密閉は火で封管しない限り無理ということです（注意：クロロホルム溶液は火で封管しようとすると、有毒ガスのホスゲンが出ますので駄目ですよ）。

おそらくですが、10 mM の効き目は数日以内かもしれません。もし、試料溶液をシゲミ製造のすばらしいガラス管の底に注ぎ入れ、ピストンを差し込むのに数分間もたついた場合には、もはや DTT の効果は０と考えてもよいでしょう。また、DTT の臭い匂いが残っていても、これは還元力とは関係ありません（安心しないで）。それに DTT には 1H が一杯付いていますので、10 mM も入れると蛋白質試料 0.1 mM の 100 倍以上の強度のピークが出てしまいます。その状態で NOE をとってもアーティファクトにただただ悩まされるだけです（このような場合、普通は高価な重水素化 DTT を入れます）。

DTT (dithiothreitol) = HS-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH

このアーティファクトのピークについては、また別の機会に触れることにしましょう。

また、蛋白質を凍結乾燥すると、このような小さな分子は飛んで行ってしまっているかもしれません。ですので、それに水を加えて再生させる場合には、DTT を新たに加えてあげましょう。よくこの追加を忘れて（あるいは、第三者に凍結乾燥品を渡した際に「DTT 入りの水で溶かすのだよ！」という注意点を伝え忘れて）金粉より高価な白粉をエッペンドルフの底に見る羽目になってしまうのです。

このような Cys を一個でも含む蛋白質は、精製の初期段階から 1 mM DTT を精製用 buffer 全てに入れておくのが良いでしょう。しかし、最近は His-tag Ni キレートカラムがよく使われ、これに DTT 溶液を注ぐと、おいしいメロンソーダが、これもまた美味しそうなチョコレートパフェに一瞬で変身してしまいます。これは新人（新入生）に体験してもらうのが良いですので、あまり教えないでおきましょう（ただし、捨てる寸前のカラムを渡しておく）。

あれ？書きたい本命に行く前にすでに１頁を超えてしまいました。以上は前置きです。いずれにしても、例えば 2H, 15N, 13C で標識した、たった 300 uL で数十万円もかかったような試料では、たとえちゃんと DTT を入れていても何ヶ月も同じ再現性あるスペクトルを期待するのは難しいといえるでしょう。NMR のプローブ内の温度調整は窒素ガスでなされている場合が多いので、あとは窒素ガスで満たした冷蔵庫があると良いのかも。

広幅化した所に交換あり

一昨日の論文 Science に Rex を決めたと書かれていましたので、その論文を引いてみました。

Wang, C., Rance, M., Palmer, III, A.G. (2003) Mapping chemical exchange in proteins with MW > 50 kD. J. Am. Chem. Soc., 125 (30), 8968–8969.

詳細は論文を参照して頂くこととして、この測定法の要点だけを簡単に？書いてみることにしましょう。

交換速度 Rex は、線幅の増幅という形で観ることができます。R2 を見かけの（apparent な）横緩和速度、R2o を本当の横緩和速度とすると、R2 = R2o + Rex となります。半値幅（ピークの高さが半分の所での線幅）は、R2/π となりますので、Rex が載れば載る程、線幅が拡がってしまうわけです。蛋白質の HSQC スペクトルなどで、「この蛋白質には構造あるいは化学交換があるので、ピークがブロードになっていますね」などとよく表現します。

さて問題は、どのようにして R2 と R2o を見分けるかです。これが分かれば自動的に Rex が求まってきます。簡単な方法としては「異様に R2 が大きい箇所には Rex があると思え」という方法です。これは原始的ながら的を得ていまして、HSQC でピークがブロードになったり、もはや観えなくなっている箇所には、かなりの確率で構造（化学）交換があります。

さて、上記の論文では、この原始的な方法を基にしながら、もう少しこれを格好良く裁いています。一つは R2 の代わりに R2α を使っています。ここで R2α とは TROSY ピークの横緩和速度の事です。したがって、高分子でも観えるという戦法です。15N のピークは、1HN が上向きスピン（α としましょう）にあるか、下向きスピン(β としましょう）にあるかによって、横緩和速度が異なってきます。この二重分裂線 doublet の横緩和速度の差が交差相関横緩和速度（の２倍 = 2*ηxy）です。要は doublet それぞれの半値幅を測り（R2α /π と R2β /π）それら同士を引き算すればよいわけです（R2β - R2α = 2*ηxy ここでは /π を両辺から省きました）。

この交差相関（横）緩和速度 ηxy についてですが、これには Rex が含まれていません。Doublet それぞれに同じ Rex 値が載っていますので、それら同士を引き算して求めた ηxy には、もはや Rex が入って来ないのです。

さて、一連のアミノ酸残基の R2α を見比べる際に、これを自分の残基の ηxy で割って規格化すると、たいへん都合が良くなります。しばしば、R2/R1 から分子の回転拡散の相関時間 τm を求める方法が使われますが、これと良く似た考え方です。他にも、ηxy/ηz を使う方法もあります。割り算をすることによって、さまざまな項を打ち消させるのです。では、R2α/ηxy の計算では何が打ち消されるのでしょう？

R2α = (d^2+c^2) { 4J(0) + 3J(ωN) } /2 + d^2 { J(ωH-ωN) + 6J(ωH) + 6J(ωH+ωN) } /2 + Rex - η

η = dc { 4J(0) + 3J(ωN) } (3 cos^2(θ)-1) /2

ここで、d は双極子双極子相互作用に関する定数、c は化学シフト異方性に関する定数です。このような複雑な式どうしを割り算しても何も面白そうな項が出て来そうにないように思えますが、実は高分子では R2α はもっと簡単に下記のように近似されます。

R2α = (d^2+c^2) { 4J(0) + 3J(ωN) } /2 + Rex - η

それは、高分子になるほど分子はゆっくりと回転し、J(0) や J(ωN) などの低周波数成分が多くなり、J(ωH) 周辺の高周波数成分が少なくなります。低分子ですと、分子は高速回転しますので、J(ωH±ωN) 成分もまずまずの大きさを持ってしまいます。しかし、この方法は論文の題名にもある通り、50 kDa を超える蛋白質が相手です。すると、

R2α/ηxy = (d^2+c^2) / { dc (3 cos^2(θ)-1) } + Rex/ηxy - 1

となります。角度 θ は化学シフトテンソルの主軸と 1H-15N ベクトルとがなす角ですが、これは残基間であまり大差は無いと仮定すれば、R2α/ηxy は、Rex が混ざって来ない限り、単なる定数に近くなるのです。もし、上式のように Rex が混じっていると、Rex/ηxy の分だけ大きめの値をとります。このようにして、どの残基に Rex が含まれているかを判定しようとしたのが今回の論文です。

ただし、もう少し定量的に解析しています。R2α を求めるために 15N を横磁化にしてある期間だけ待っているのですが、この横磁化はその間に 1J-coupling により次のように変化して行きます。

2NyHz → -Nx → -2NyHz → Nx → 2NyHz

これで 2/J 時間だけ待ったことになります。すると、同位相である Nx の横緩和速度を計りたいのに、反位相である 2NyHz の緩和速度も半分だけ混じってきます。そこで、純粋な Nx の横緩和速度を測るために、どのようにして 2NyHz の緩和速度を見積もるかです。これには少し近似を使います。2NyHz の緩和速度は、Nxy の横緩和速度と Hz の縦緩和速度の足し算だと仮定するのです。本来は、両者が極端に違う大きさの場合にしかこれは成り立ちません。そして、Hz の縦緩和速度を測る代わりに、2NzHz の縦緩和速度を測ります。これも、Nz の縦緩和速度と Hz の縦緩和速度の足し算だと仮定できますが、高分子では Nz の縦緩和速度は非常に小さいので、これを無視します。このようにして、2NzHz の縦緩和速度を Hz の縦緩和速度とみなします。そこで、R2α* - R1(2NzHz)/2 を計算すると、同位相としての R2α 横緩和速度を求めることができます。まとめると

(R2α* - R1(2NzHz)/2) / ηxy + 1

R2α* は、同位相 Nx の横緩和速度と反位相 2NyHz の緩和速度の平均

を計算し、それが大きな残基は Rex/ηxy を含んでいるということです。いろいろと複雑な計算をしていますが、突き詰めていくと、やはり「異様に R2 が大きい箇所には Rex があると思え」に戻りそうです。

最後ですが、緩和速度どうしの引き算を計算するには、必ずしも半値幅どうしを引き算する必要はありません。ピーク強度どうしを割り算すれば良いのです。ピーク強度は例えば Io*exp(-Rt) と表されます。そこで、ピーク強度どうしを割り算すれば、exp の中は引き算になるのです。

長らく更新していなかったので、全部消されてしまいはしないかと心配でした。ここで更新しておけば、少しは安心です。

閉じて開いて

前回の投稿から 1.5ヶ月も経ってしまい、続きを書こうと思っても書いた本人ですら内容を忘れてしまっているという始末です。前回の内容を思い出すのに少し時間がかかりそうですので、今日は題材を替えて下記の論文を読んでみることにしました。

Whittier, S.K., Hengge, A.C., and Loria, J.P. (2013) Conformational motions regulate phosphoryl transfer in related protein tyrosine phosphatases. Science 341 (6148), 899-903.

このように蛋白 NMR 分野の論文が Nature や Science に出るのは嬉しい限りです。しかし、それにしてもこの５年間ほど R2-dispersion（緩和分散法）の論文が多いです。つまり、どちらかと言うと、蛋白質の物性的な側面を NMR で明らかにしたという基礎的研究の傾向が強いということでしょうか。しかし、今回の論文は同じ R2-dispersion でも少し？毛色が違います。今までは、例えば「酵素 A の open ←→ closed の動きが、基質が入り生産物が出ていくという代謝回転（turnover）と呼応しているよ（特に product の release が）」 という内容が多かったのです。ところが今回の論文は「Tyr-脱リン酸化酵素の open ←→ closed の動きが、リン酸基の切断反応と呼応しているよ」という結果を示しています。つまり、単なる「出入り」ではなく「化学反応」が、酵素の動きと呼応しているということです。

この論文では二つの phosphatase (PTP1B, YopH) が出てきます。二つとも立体構造や配列など色々な点で似ているのですが、どうも触媒反応速度が大きく異なり、YopH の方が 20 倍ほど速いらしいです。その理由がこの研究で分かりました。どうも反応に関与している活性ループ部分（10 残基）の動きが、YopH の方が速いらしいのです。このループは WPD-ループと呼ばれており、その中のアスパラギン酸が基質であるリン酸化チロシンにプロトンを与えます。すると、リン酸基がチロシンから外れて酵素の別の部分に付きます。チロシンを含んだペプチド部分は酵素から離れて行きます（以上が cleavage 反応）。そして、次にこのリン酸基が加水分解され、無機リン酸が酵素から離れることによって（これが hydrolysis 反応）一連の酵素反応が終わります。

したがって、この WPD-ループがゆっくりと close する PTP1B では、前半のプロトンを付加する反応も遅くなってしまい、結果として全体の酵素反応が遅くなるのです。この WPD-ループは、基質が無い状態では 10Å ほど離れた所にあり（open 状態）、数% の割合で活性部位にまで（closed 状態）揺れて来ます。いわゆる open ←→ closed の動きですが、open 状態が major (97.5%) です。この closed 状態に行く速度定数（k-close）が上記の切断反応の速度定数（k-cleavage）とほぼ同じでした。しかし、PTP1B では k-close = 22, k-cleavage = 25~80 /sec であるのに対して、YopH では k-close = 1,240, k-cleavage = 1,400 /sec と両者ともに速いのです。

次に、分解されないような模擬基質を入れて、複合体の状態で R2-dispersion を測ってみました。すると、k-close はあまり変わらなかったものの、k-open が極端に遅くなりました。これにより、今度は closed 状態が major となったのです。このように k-close がそれぞれの酵素で異なるものの k-cleavage と同じような値に維持されるというのは非常に興味深い結果です。まさに WPD-ループが閉じてきて、基質にプロトンを与えることにより切断反応が進むことを反映しています。

最後に、模擬生産物であるタングステンを入れてみました。すると、どちらの酵素も同じような速度定数でタングステンを放しました。したがって、一旦 cleavage と hydrolysis が終わると、生産物の放出は両者の酵素で同じように起こる（WPD-ループが同じような速度で open する）ということです。ここまで来ると、なかなか神秘的な感じもします。

なぜ、PTP1B の WPD-ループがゆっくりと閉まるのかについてはよく分かっていないようです。論文には中に Pro があるためではないかと書かれています。切断反応自身は、もっと速く（fs ぐらい？）起こっているので、まさにこの閉じる運動が律速になっています。きっと進化の過程でこのような差が意味をもって生じてきたのでしょう。