蛋白質どうしの切り貼りが簡単に

溶け難い蛋白質をどのようにして無理矢理にでも溶かすか？一つの方法として、良く溶けることがすでに分かっている蛋白質と融合させてしまう、つまり、fusion-protein として発現させてしまうという方法があります。例えば、よく使われる GST-tag などは、もちろん affinity-カラムを使って効率良く精製するためが主な目的なのですが、GST そのものが良く溶ける蛋白質であるため、その後ろ（あるいは前）に繋がっている目的の蛋白質もつられて溶けてしまうという性質をもたぶんに活用してもいます。ですので、精製がある程度進んだ段階で、GST と目的の蛋白質をプロテアーゼで切り離すと、途端に目的の蛋白質が沈殿してしまったなどという事は頻繁に起こります。

では、もう切り離すのは止めて、その fusion のままで NMR を測定してみては？ということになります。ところが、大腸菌などで fusion-protein を発現させると、目的の蛋白質だけでなく、タグ側の GST も 15N (13C) で標識されてしまい、NMR スペクトルは両者のピークが混在するという悲惨な状況になってしまいます。

これを防ぐには、GST-カラムのレジンに GST 部分だけをくっ付けたままで NMR を測定するという方法があります。あれ？その論文は何処に行ったのだろう？ちょっと探してみたのですが、見つからなかったので、同じ著者の関連論文を挙げておきます。

Hayashi, K. and Kojima, C. (2010) Efficient protein production method for NMR using soluble protein tags with cold shock expression vector. J. Biomol. NMR 48, 147-155.

レジンにくっ付いた GST は超高分子量になってしまいますので、ピークがブロード化し過ぎて見えなくなってしまいます。一方、その後ろに繋がっている目的の蛋白質は、長いひもで繋がれた子犬のように、あちこちを泳ぎ回るので、ピークが見えるというしくみです。

しかし、もし、GST などのタグ蛋白質部分だけが非標識で、目的の蛋白質部分だけが 15N, 13C で標識されていたら、これほど嬉しい事はないわけですが、それが何と可能となりました。

Kobashigawa, Y., Kumeta, H., Ogura, K., and Inagaki, F. (2009) Attachment of an NMR-invisible solubility enhancement tag using a sortase-mediated protein ligation method. J. Biomol. NMR 43, 145-150.

タグはタグだけで非標識の培地で発現させます。一方、目的の蛋白質は 15N/13C の入った M9 最少培地で発現させます。そして、それらを後で融合させるのです。

蛋白質どうしの融合という方法には何通りかありますが、有名なのが「インテイン」を使った方法です。

Otomo, T. Ito, N., Kyogoku, Y., Yamazaki, T. (1999) NMR observation of selected segments in a larger protein:  central-segment isotope labeling through intein-mediated ligation. Biochemistry 38, 16040–16044.

1999 年の発表ですか。。。時の経つのは速いものですね。

邦文の総説を見つけました。

湊雄一, 上田卓見, 町山麻子, 嶋田一夫, 岩井秀夫.「区分標識法によるマルチドメイン蛋白質の NMR 解析」日本核磁気共鳴学会誌 Vol. 3, pp. 11-18.

ヘルシンキ大学の岩井先生の総説ですね。うれしい事に one-click で本一冊まるごとがダウンロードされてしまいました。。。

しかし、この方法では、蛋白質を一度 unfold させないといけないので、refolding が可能な（いわば頑丈な）蛋白質にしか適用できないという欠点があります。ところが、上の Kobashigawa, Y. et al. の方法は、sortase （ソルターゼ：グラム陽性菌でペプチドグリカンを作るのを触媒するトランスペプチダーゼだそうです）を使って、一種の切り貼りをしてしまおうというわけです。たいへん面白いですね。

著者らは、さらにいろいろな工夫を凝らして効率を上げています。例えば、ソルターゼは酵素ですので、逆反応も触媒してしまうわけです。つまり、「切り」と逆の「貼り」の両方を同時に進めてしまう。これでは、行ったり来たりで前進０です。そこで、tag と目的の蛋白質を融合させる際に出てくる（何と表現すれば良いのでしょう）切り代（しろ）？をせっせと取り除き、逆反応が進まなくなるように工夫しています。切り代は小さいですので、透析で除くのです（つまり、何もせずに放っておくだけで良い）。

その他の詳細は Kobashigawa, Y. et al. に載っておりますので、是非読んでみてください。また近々「生物物理学会誌」にも総説が載るとの噂です。

GPCR の NMR 解析 1

● これまでの GPCR の構造解析 

G 蛋白質共役受容体（GPCR）は、細胞膜に埋まった蛋白質で、細胞の外側に付いたホルモンや神経伝達物質などの情報を細胞内に伝える働きを担っています。このようにシグナル伝達の開始部分のスイッチとして働いているため、全創薬の 30-40% ほどのターゲットになっているらしいです。つい最近まで、ロドプシンを除いて GPCR の立体構造は解かれてはいなかったのですが、2007 年に β2アドレナリン受容体の結晶構造が決定されました。その後、2012/12 までに 13 個もの GPCR の構造が決められました。

● 試料条件 

そして、とうとう NMR でも構造決定が報告されました（Park, S. et al. (2012) Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature 491, 779-784.）。GPCR は７本の α-へリックスが細胞膜に埋まったような形をとっています。そのため、もし、これを溶液 NMR で解析しようと思うと、界面活性剤（detergent）でミセルを作り、そこに GPCR を埋めることになります。この界面活性剤が GPCR に付いた姿は、ちょうど「おたまじゃくし」が尻尾の部分で GPCR の膜貫通部分を覆いながら立ち並んでいる（あるいは、GPCR の膜貫通部分にふわふわと産毛が生えている？）ようです。したがって、細胞膜に埋まっているような実際の膜環境とはかなり異なります。また、結晶構造解析の場合でも、抗体がくっついていたり、リゾチームが融合されていたりと、少し人工的な物が加えられています。それに対して、上記の論文では、GPCR はリポソームに埋め込まれたプロテオリポソームと呼ばれる環境で固体 NMR により解析されています。この溶液条件は、自然の生理的条件にかなり近いと言えるでしょう。 

● 固体 NMR の何を利用したのか？ 

ここで採られた手法の詳細を理解するのは難しいのですが、次の二点が挙げられています。１）ガラス板に挟まれた脂質二重膜に対象とする蛋白質を埋め込んであげると、その蛋白質は脂質二重膜の法線周りに速く回転します（法線とは、脂質二重膜の地面に突き刺して真っすぐに立てた旗です）。この状況で双極子カップリング（dipolar coupling）を測定すると、例えば 1H-15N, 1H-13Cα ベクトルそれぞれの法線に対する角度を見積もることができます。ところが、15N/13C で均一標識した試料では、13C-13C 間の双極子カップリングがスペクトルを複雑にしてしまい、そのためにいろいろな 1H/15N/13C 三重共鳴測定が出来ないのです。これはもったいないです。実は、２）Magic-angle-spinning (MAS) と呼ばれる方法で、試料管そのものを機械的に高速に回転させると、この双極子カップリングを消すことができ、ピークをシャープにすることができることが昔から知られ、一般的によく使われてきました。そこで、著者らは両者を結び付けるというアイデアを思い付きました。 

まず、MAS で機械的に高速回転させてもよいようなリン脂質の環境として、リポソームを選びました。リポソームに埋め込まれた [15N/13C]-GPCR は、やはり法線周りに速く回転しますので、1H-15N, 1H-13Cα 双極子カップリングから、それぞれのベクトルの法線に対する傾き角を得ることができます。このプロテオリポソームは丸い形をしていますので、（ガラス板に挟まれた脂質二重膜などとは異なり）MAS で高速回転させても平気です。この MAS を使うと、本来はせっかくの 1H-15N, 1H-13Cα の双極子カップリングも消えてしまうのですが、著者らは、これら重要な双極子カップリングは消さないようなパルス系列を開発しました（dipolar recoupling）。これにより、MAS を使いながら、リン脂質膜の法線に対する結合ベクトルの向きを得ることに成功しました。 

上記のような解析方法ですので、今回の論文では、距離情報ではなく方向情報（法線に対する結合ベクトルの角度）が構造の計算に使われています。溶液 NMR でも、試料をアクリルアミドゲルの中に入れてかすかに配向させると、この dipolar coupling を観測でき、結合ベクトルの方向情報を得ることが出来ます（残余双極子相互作用用、RDC）。GPCR の α-へリックスは法線とかなり平行に配置されています。そのため、へリックス内の一連の 1H-15N ベクトルは、法線とある角度を維持して傾いています（1H-15N ベクトルは、α-へリックスの中心軸に対して完全に平行というわけではありません）。もし、へリックスの向きが変わると、その傾き角が dipolar coupling に反映され易く、従来よりも精度の高い構造を決めることができるでしょう。 

もちろん、dipolar coupling だけで構造を決めるのは大変危険なのですが、すでに似た構造が結晶で決定されているので、大きく間違えてしまうということはないと思います。また、最近、化学シフト値そのものをデータベースと照らし合わせて、それから主鎖の二面角を決める MD ソフト（CS-ROSETTA）が開発されてきています。この貢献も多大と言えるでしょう。

In-cell NMR の out-cell 測定

先々週は嵐の週末でした。土日の両方まで雨に降られれてはご免と、土曜日は必死に仕事を片付け、なんとか久しぶりの日曜日という休日を得たのでした。締め切りがすでに超えてしまった書類も無いわけでは無いのですが、そこは何とか。。。久しぶりに休みをとると、どうやって過ごしてよいのか分からなくなってしまい、しかたなく朝から下の論文を読み始めましたが、これがなかなか面白いのです。

Latham MP, Kay LE. (2013) Probing non-specific interactions of Ca(2+)-calmodulin in E. coli lysate. J. Biomol. NMR 55, 239-247.

Latham MP, Kay LE. (2012) Is buffer a good proxy for a crowded cell-like environment? A comparative NMR study of calmodulin side-chain dynamics in buffer and E. coli lysate. PLoS One 7, e48226.

もしかして、L. E. Kay さんまでもが In-Cell NMR を？と初めはびっくりしたのですが、どうもそうではなく、ちゃんと精製した CaM（カルモジュリン）蛋白質に大腸菌の中身（菌溶解物）を振り掛けて測定しているのです。結論を先に書いてしまいますと、菌溶解物の中には CaM と（非特異的に、瞬間的に）相互作用できる蛋白質やペプチド断片が多くあるらしく、それらが CaM と付いたり離れたりを繰り返すのです。したがって、この交換（Rex）による横緩和（R2=1/T2）の促進が 1H-CPMG 実験などで観測されたのでした。ちなみに、この CPMG 実験ではミリ秒程度の動きが Rex という形で観測されます。

面白いのは、この CaM に最初から相互作用の相手であるペプチド（smMLCK(p)）をくっ付けておくと、そのような Rex は観測されないとの事です。この相手方ペプチドとの相互作用の解離定数は 1 nM 程度との事ですので、もう一度付いたら二度と離れないというぐらいにたいへん強いのです。一方、大腸菌溶解物の中の蛋白質（ペプチド）との非特異的相互作用では、強くて 200 μM 程度との事ですので、CaM の二次元スペクトルをかなり劣化させてしまうという程度の強さでしょうか。

ところで、上記の CaM とは、すでに Ca++ を配位させた Ca++CaM の事なのです。apo か holo かを区別せずにこの２報を読んでいくと、途中で頭が混乱してしまいました。

CaM に４つの Ca++ を配位させると CaM の構造が大きく変わり、疎水コア内部にあったメチル基が表面に飛び出してきます。そこで、各種のペプチドと相互作用ができるようになるわけです。ですので、Ca++ の付いていない apo 型で測った 1H-CPMG 実験では Rex の大きさは半分程度になってしまいます。そして、それらは Ca++ の脱着に因る Rex なのだそうです。

さて、この実験では、メチル基を観測しています。普通は 15N-1H を観る場合が多いのですが、すごく大きな蛋白質であったり、今回の lysate のようにドロドロとした環境では、たとえ 1H-15N TROSY を使っても観えない場合があります。そのような時は、Ile, Leu, Val, Met のメチル基だけを 13C-HDD に標識し、その他の箇所は 12C, 2H に標識する方法があります。大腸菌発現系において、そのような前駆体を入れるのです。

では、何故 13C-HDD であって、13C-1H3 を使わないのか？後者の方が methyl-TROSY が使えてもっと良いのでは？と思ってしまいます。論文によると、１）13C-HDD の方が 1H-CPMG が解析し易い（13C-1H の２スピン系としてモデルを組めますよね）２）2H の緩和も観られる（2H の緩和は四極子緩和のため非常に速く、Rex にほとんど邪魔されない）３）lysate の中にある大量の 13C-メチル基（もちろん、natural-abundance です）から区別できる。確かに 2H で磁化移動を edit すれば良いですね。なるほど。。。感心です。

9.4 テスラの MRI は？MHz

「化学や生化学の実験で使っている NMR と、病院で使われる MRI は基本的には同じです」とよく見学者に説明することにしています。「しかし、NMR のように上空から穴の中に飛び込むのは流石に怖いですよね。だから、MRI は寝転びながら磁石の中に入れるように横向きになっているのです ... 。」などと言うと、「なるほど！」と強い関心を持って頂ける。そのような訳で、時々 MRI の記事や論文も読むのですが、「人の頭の断層写真を撮るのに 9.4 T（テスラ）の磁石を使っている」などと書かれていても、9.4 T は 1H 周波数に換算すると何 MHz ???? 大きいのか小さいのかピンと来ないのです。

そこで、換算式をググってみると、

1 T = 42.58 MHz
1 T = 42.576 MHz
1 T = 42.577 MHz

などなど、これらの前後の値がいろいろ目立つことに気付きました。どの値がいったい本当なのでしょう？

そこで、理科年表（H15 年版）の定数をもとに計算してみることにしました。このブログではギリシャ文字が使いにくいので、下図を使って、きれいなフォントで示すことにします。




単純に 1H の磁気回転比を使うと、

1 T = 42.5764011 MHz

となりました。もちろん、有効数字が何処までかなどの細かい点は無視していますので、末桁の数値は信用しないでください。ちなみに、磁気回転比の値は、

Park, P.G. and Kim, Y.G. (2003) Magnetic flux density standard based on the proton gyromagnetic ratio. Journal of the Korean Society 42 (6) 751-754.

から採りました。一方、磁気回転比を 1H の磁気モーメントとプランク定数から出してくると、

1 T = 42.5774825 MHz

になってしまうのです。このように、どの定数を使うかによって、小数点３桁目に少し違いが出てきてしまうわけですね。

困ったな。。。と思ったのですが、結局、MHz と T の換算表を作り、小数点１桁までテスラ値を四捨五入してみると、どちらを使っても同じ値になってしまいました。何をそこまで苦労していたのだか。



それにしても、覚え難いですね。43 という数値を覚えていたら、およその計算が頭の中で出来るでしょうか？あるいは、

20 T = 850 MHz

と覚えておいて、ここから概算で暗算すれば良いでしょうか？あるいは、

7 T = 300 MHz

の方が良いでしょうか？（厳密には、7.05 T = 300 MHz であるので、900 MHz では 21.14 T と繰り上がってしまう。）うーん、この最後のが良いかもしれません。7 と 3 を足すと 10 ですし（何というこじつけ）。この装置が新潟大学や岩手医科大学で動いているそうです（もうすぐ阪大でも）。では、やはりこれを基準にすることにしましょう。

Fast-exchange でも油断はできない

NMR で観測対象となっている分子が交換状態にあるとします。この時の交換とは、立体構造 conformation が揺れている、化学結合が繋がったり切れたりしているなど、およそ化学シフトが変わるような現象なら何でも考えられます。その場合、一般的に kex (1/sec) = Δw (rad/s) / √2 の条件に近づく程、融合したピークが広幅化します。しかし、これよりもずっと速い交換状態の時、果たしてピークの広幅化は起こるのでしょうか？

まず、このような fast-exchange の系では、ピークが融合されて一本になります。例えば、A ⇔ B と二つの状態で化学シフトが両者の間を速く行き来している時、A にある状態の割合が Pa としますと、B にある状態の割合は Pb = 1-Pa となります。そして、融合したピークは、化学シフト δ = Paδa + Pbδb の位置に現れます。これを加重平均（weighted average）と呼ぶらしいです。

さて、それでは、線幅（横緩和）はどのようになるのでしょうか？横緩和についても R2 = PaR2a + PbR2b と加重平均になってくれると大変うれしいのですが（＊）、そう簡単ではなく、これにさらに、PaPb(Δω)^2 / kex なる項がくっ付いて来るのです。この PaPb が何処で最大になるかというと、Pa = Pb = 0.5 の時です。つまり、A と B のモル比がちょうど同じになった時に、fast-exchange と言えども、線幅が最大になってしまうのです。

（＊）厳密には、化学シフトの場合でも、理想的に速い交換の場合しか完全な加重平均にはなりません。

次に、例えば A という分子に何か相互作用する相手方分子 X を滴定して行くことを考えます。そして、複合体を B とします。この場合は、A + X ⇔ B のような交換状態となります。このように X という第三者が入ってくる場合は少し式が複雑となり、A 分子のうちの 1/3 が複合体である B 分子になった時、つまり Pb = 1/3 の時に、ピークがもっとも広幅化してしまうのです。したがって、滴定を始めると、少し進んだ辺りでピークがどんどんブロード化して観えなくなってしまうこともあるわけです。実は、Pa = Pb = 0.5 の条件では、この時に加えている相互作用の相手方分子 X のうち、複合体になっていない依然 free の分子の量が解離定数（Kd）の値に一致します。したがって、Pa = 1/2~2/3 の領域は、解離定数を調べるのに非常に重要な滴定領域だと言えます。このよりによって大変重要な所で、下手をすると、ピークが観えなくなってしまうなんて。。。。



まだ寒い状態だと言うのに、外の桜はもう７分咲き程度です。「７分咲き」とは、どのような状態を指すのでしょう？

「生命と物質 -生物物理学入門-　永山國昭著」

に依りますと、次のように説明されています。桜の一つの花をよく観ると、花びらが（完全に閉じている） ⇔ （完全に開いている） という２状態転移にあります。これは、あくまで一つの花についてです。７分咲きとは、桜の木の中で花びらがまだ閉じている花が３割（例えば、3,000 花）、そして残りの７割（例えば、7,000 花）の花びらが完全に開いている状態を云うのだそうです。決して、「花びらが法線から 90° × 0.7 程度の角度で開いている」という意味ではないのだそうです。

そうか！確かに蛋白質の unfold ⇔ fold もそうだと、目から鱗でした。

1999 年にこの本を買って以来、これを超える本は存在しないと聖書のように祭ってきたのですが、今日、桜の木の下でじっと観てみると、いろいろな角度で開いている花びらがあるではないですか！桜の花は、もしかして８状態転移ではないでしょうか？

Intermediate-exchange とは何処の事？2

またまた前回のブログでは、図を出さずに文章ばかりで埋めてしまいました。そこで、同じような内容を今回は図付きで。




この一次元のスペクトルは、A ←→ B という二つの状態の間で交換が起こっている様子を示しています。A, B は、具体的に立体構造が換わって化学シフトが変化している状態と考えてもよいですし、あるいは、化学結合が生成消滅したりしている状態と考えても構いません。要は、化学シフト値が変化することが重要です。この化学シフト値をそれぞれ 70, 30 Hz とします。普通は ω(rad/s) で表しますが、ここではあえて ν(Hz) で表すことにします。当然、これを ppm 値に変換すると、NMR の静磁場 B0 の大きさによってその ppm 値は変わります。

さて、左右ともに真ん中の図が kex (1/sec) = Dw (rad/s) / root(2) の条件の時のスペクトルです。たいへんブロードになっており、これぞ intermediate-exchange と言えるでしょう。さて、左上の図は、√2 を消した時の条件です。そのため、少しだけ fast-exchange に寄りますので、ピークがシャープになっていることが分かります。一方、左下の図は rad/s ではなく、Hz をそのまま使った時のスペクトルです。先ほどの図よりも 2*pi = 6 倍ほど slow-exchange の方に偏りますので、すでにピークが二つに分かれています。

右の上と下の図は、もっとも intermediate-exchange の条件から kex を 10% だけそれぞれ fast-, slow- に偏らせた時のスペクトルです。よく見ると、右下のスペクトルがもっともブロードです。しかし、これはダブレットが繋がったものですので（勝手に）除くことにしましょう。

これらのシミュレーションでは、A と B がそれぞれ 50:50 にある時の状態を想定しています。もし、fa (fb) が 50% から離れた状態では少し様子が変わって来るでしょう。いずれにしても、kex は /sec 単位であるが、比較の対象となる化学シフト値は rad/s 単位であること、その化学シフト値の差 (rad/s) を√2 で割った値と kex とを比べることが重要だと言えそうです。

なお、同じ試料を大きな NMR に持っていくと、全体的に slow-exchange の方向にずれることに注意しましょう（ppm 値では同じでも、rad/s, Hz で表した化学シフト値の差は増えるから）。ですので、もともとが少しだけ fast-exchange の場合に、超高磁場 NMR で測定すると、運悪く intermediate-exchange に被ってしまうこともあり得ます。「400MHz では確かに観えたピークが 800MHz では消えた！」などという一見？な現象もこれで説明がつきます。次回は、「Kd 値を求めるために滴定をすると、なぜ、滴定たけなわの肝心なところだけでピークが消えるの？」について触れたいと思います。

Intermediate-exchange とは何処の事？1

NMR 試料が構造交換や化学交換をしていると、NMR ピークがブロードになってしまうことは広く知られているところです。その条件をよく、intermediate-exchange の条件だと呼んでいます。それでは、さて、その条件はどのような時なのでしょうか？という問題が浮かび上がりました。 よく本を見ると、

kex > Dw (fast exchange)
kex = Dw (intermediate exchange)
kex < Dw (slow exchange)

と書かれています。ここで、kex の単位は（1/sec）であることに異存はないのですが、問題は Dw の単位です。私は（rad/s）が正解だと思っています。ところが、多くの人から「それは間違っている、正しくは（Hz）である」と指摘、撃墜され続けてしまい、おまけに、「kex と比べる場合の化学シフトの差の単位は Hz だから、気を付けるように」と書かれた教科書まで出現する始末です。

確かに、kex（1/s）と Dw（rad/s）を比べるのは変に見え、いかにも kex（1/s）と Dw/(2pi)（Hz）を比べるのが当然のようにも見えます。しかし、そんなはずはないと思い、シュミレーションしてみると、むしろ、ちょっと変な結果になってしまいました。 どうも、

kex (1/sec) = Dw (rad/s) / root(2)

あたりで、もっともブロードになってしまうのです。

また、別の本を見てみると、次の式が出ていました。

Kr = pai*(va-vb)/root(2) = pai*Dv/root(2) = 2.22Dv（Hz）

これにおいて、Kr の意味を kab だけだと解釈すると、上記の式と一致して来ます。 しかし、Kr が何故大文字で書かれているのか？とうとう、その正体が分からず断念しました。どうも、いろいろな本を見れば見る程、少しずつ違った式が表れ、ますます混乱して来ました。他にもいろいろと探していると、やっと

Sudmeier, J.L., Evelhoch, J.L., and Jonsson, N.B.H. (1980) Dependence of NMR lineshape analysis upon chemical rates and mechanisms: implications for enzyme histidine titrations. J. Magn. Reson. 40, 377-390.

に上式を支持する式が載っていました。やはり、kex (1/sec) = Dw (rad/s) / root(2) で良いのかもしれません。

ところで、上記での kex は kex = kab + kba なのです。だんだん心配になって来たことは、上記は全て pa = pb = 0.5 の場合ですが、実際には pa = 0.95, pb = 0.05 のような場合もあることです。すると、kab << kba となります。このように skewed された平衡状態においては、a 側のピークは kab に支配されて、どちらかというと slow-exchange に近くなり、他方、b 側のピークは kba に支配されて、どちらかというと fast-exchange に近くなるのではないかと思い始めました。

もしかして、試料の温度を上げたり、磁場強度を下げたりすると（つまり、fast-exchange の条件にさらに近付ける）、小さな b 側のピークは、どんどん a 側に近付いていくのに対して、 a 側のピークは強度のみが小さくなるだけで、それ程移動しないといった挙動が見られるのかもしれません。

せっかくシミュレーションプログラムを作ったのだから、試せば良いのですよね。ついでに 2D ZZ-exchange のシミュレーションプログラムも作ってみました。何を血迷ったかエクセルで作り始めてしまい、慣れない行と列の扱いで混乱。しかし、等高線プロットの色彩感覚が悪く、もう数日は練る必要がありそうです。それはそうと、転移交差飽和法の項を書きかけたままでした。早く戻らないと、どんどん脇道に逸れてしまいそうです。