2023年12月24日日曜日

つれづれ思うこと 外国語編 その2

まずは「R」の発音から。

というのは、これが最も日本人泣かせの音と言われてきたためである。しかし、ある発音の本で調べてみたところ、それほど深刻にならなくてもよいようなのである。むしろ「L」の発音の方が難しく、気をつけないといけないらしい。

ここで、少し前置きが必要なので、それを先に下に記しておく。

しばしば「R」は「巻き舌」で発音すると書かれている。筆者は「巻き舌」とは、舌先を上側へ巻き上げる(反り返らせる)ことだと長らく思っていた。しかし、本当はそうではなくて「ルルルル」という連打するような音を出すための舌を意味するそうである。そこで、ここでは、次のように区別して書いていこうと思う。

反り上げ舌:舌先を上側へ巻き上げて(反り返らせて)発音する R。アメリカ英語によく出てくる。

ルルルル舌:「ルルルル」というように舌を震わせて連打する R。イタリア語、ロシア語などによく出てくる。なんと、これが本当の「巻き舌」というらしい。

それで実際に R はどちらで発音すればよいのかといえば、どちらでも良いらしい。英語で「ルルルル舌」なんて使ってもよいのか?と思ってしまうが、昔はそのように発音されていたらしく、間違いではないのだそうだ。さらにフランス語のように喉の奥の方で「ガラガラうがい」の要領で発音する R もある。

もちろん学生の頃は、思い切り舌を反り上げて「これがアメリカ米語の R だ!」という勢いで発音していた。しかし、ヨーロッパに行くと(彼らは英語のネイティブではないが)もっと落ち着いて発音しており、ドイツでは「ガラガラうがい」音を少し弱くしたような音だった。フランス語ほどに「ガラガラ音」にするとあまりきれいな音には聞こえないのであるが、ドイツ人が発音する「微かなガラガラ音」はきれいに聞こえる場合がある。

どこかの本に Erde(earth のドイツ語)の発音について書かれていた。16 世紀に書かれた書物の中に Erden という単語をどう発音するかが書かれていたとか。独和辞典にはカタカナ発音として「エアデ」などと書かれている。最近は R がかなり母音化してしまうのである(つまり r が「ア」音になる)。しかし、この R は G 音に近く「地面」から沸き起こってくる地鳴りのような音になると書かれていたような気がする(記憶があやふや)。Erde = 地面 と意味が重なっている。この発音がフランス語から入ってきたとしばしば書かれているのであるが、そうではなくて、中世ぐらいからすでにそのように発音されていたと書かれていたような気がする(自信がないので、また確かめてみますが、どの本に書かれていたのやら?)。

しかし、これを真似しようとすると出来なかった。レストランで赤ワイン Rotwein と言いたいが、赤 Rot のように単語の頭に R があると特に難しい。ドイツ人の発音でも「ホットワイン(熱いワイン)」か「ゴートワイン(山羊のワイン)」などと聞こえる場合がある。

いくらなんでも後者の「ゴートワイン」のように聞こえるわけはないだろうと思われがちであるが、実はこれは誇張でも何でもない。ドイツ語の話になってしまって申し訳ないが、この「R」の舌の位置は日本語のガ行を発音する時の位置に近いのだそうである。つまり、舌先が下に落ちている。これはガ行を発音する時の舌の位置と同じ。そして、舌の根本をもち上げて、喉の奥を狭くする。極端に狭くすると「G」音になってしまう。その時は「これでは反り上げ舌とは全く逆の舌先の位置ではないか」と思い、たいへん困ってしまった。しかし、また別の本には、これらは舌の奥を持ち上げるという点では共通しているのだとも書かれていた。そうなのかな?

いずれにしても、英語の「R」もガ行と同じ舌使いでやってみようと考えた。そこで、grow, green, grape など、G の直後に R が続く単語の発声を何度も練習した。舌をなるべく動かさないようにして GR の部分を発音するのである。なるほど、GR と音が続いていると、ドイツ人のような R の発音が簡単にできた。しかし、やはり Rotwein のように頭に R が来るとダメだった。

NMR の研究者でスイス人はたくさんいるが、ある有名人はものすごく「ルルルル舌」が目立つ。一度、お父様といっしょに来日されたことがあり、二人で母国語をしゃべっていたのであるが、その時も R の部分は全て「ルルルル舌」であった。まあ当然か。ミュンヘンより北部でそんな「ルルルル舌」を聞いたことがなかったので大変驚いたが、英語で発音する「ルルルル舌」もなかなかカッコ良かった。Related residual cross-correlated relaxation(関連する残余交差相関緩和)なんて、聞いてみるとすごい発音だった。しかし、ちゃんと L は正しい L の発音であり、R と L の音がひっくり返っていることはなかった。

そこで、GR 舌方式をちょっと諦め「ルルルル舌」を試すことにした。昔「(第二ではなく)第一外国語」がロシア語であったため、この「ルルルル舌」はそれほど不得意というわけではない。しかし、R がどこかに出てくるたびに「ルルルル舌」をやっていると大変疲れ、おまけに周りからは「あいつ、アホちゃうか?」という目で見られる始末。そこで、またまた調べてみると、この連打を一回だけにしてもよいとのことである。つまり、「ルルルル舌」を「ル舌」にするという意味。舌を口の上部に瞬間的に当て、一回だけ弾くのである。難しそうに見えるが、実は「カレー」の「レ」、「セロリ」の「ロ」と同じなのだそうだ。ここでびっくり。ずっと R の発音が難しいと思っていたら、なんと日本語の「ラ行」とそれほど変わらない音でも OK とは。これが上記で、R は適当に発音してもよく、むしろ L の方を注意しないといけないと書いた理由です。

もちろん、舌先が口内の上部に一回だけパチンとぶつかるので、英米のネイティブの発音とはかなり違ってくる。発音に厳しい人からすると、それはけしからんとなるのであろうが、書籍によると、昔は R をそのように発音していたのだとか。なので、同じ祖先をもつヨーロッパ言語(イタリア語、ドイツ語、スペイン語、ロシア語など)でも「ルルルル舌」が使われているのだそうである。

これの欠点?「反り上げ舌」でかっこよく見せようと思っていたのに、「ルルルル舌」で馬鹿ではないかと見られることかな。。。。まあ、しかし「ル舌」ぐらいであれば、ちょっと下手なカタカナ英語かなというぐらいの見られ方で終わるでしょう。

書籍「脱・日本語なまり」(神山孝夫著)は名著です。かなり専門的な内容でありながら、素人にも分かるような書き方がなされています。そして、著者はアメリカ発音があまりお好きではないようですので、米式発音が好き!という人は見ない方がよいかもしれません。あるいは敵だと思って読んでみると「目から鱗」になるかも。これを読んでから他の発音の本を見てみると、その多くが米語発音に偏っていることが分かります。

上記で、アメリカでは R に反り上げ舌を使い、イギリスでは無視する(「ア」のように、ほとんど母音化する)ということを書いた。しかし、堀田隆一氏の書籍だったような気がするが、次のような事が書かれていた。アメリカでもニューイングランドや南部では "今の" イギリス英語のような R 音を使う。その理由は、昔、ロンドン周辺でその発音しない R が使われており、そこからの移民が多く住み着いたためだそうである。一方、スコットランドやアイルランドでは「反り上げ舌」が使われており、そこからの移民がアメリカ西部を開拓していった。よって、R 発音の違いは英米の違いというより、もともとのイギリスでの方言の違いに由来しているらしい。その意味では、アメリカ英語はむしろ保守的で、そのため広い国土の割には方言が少ないとのことです。なるほど、アメリカ発音の方がちょっと古式で今もそれを引き継いでおり、一方、イギリス発音はその後の変化も加わって今のような発音になったんだ。。。。

まとめると、「反り上げ舌」はアメリカに残る昔の(スコットランドやアイルランドの)発音で、これが英語のすべてだとは思う必要はない。よって、中学校で英語を習い始めて「反り上げ舌」をひたすら練習し、これができないと英語ダメ人間になるなどと思い煩う必要はない(英語ができない場合の日本人の劣等感は、外国人にはまず想像できない)。難しいようならば、日本語のラ行(「カレー」の「レ」)で OK。NHK のラジオ英語講座などは昔からアメリカ英語の発音を重視しており、少し偏りがある。それが英語だと思っていると、ヨーロッパではびっくりする。むしろ、重要なのは「L」の発音であり、カッコいい英語にしたいならば、こちらを徹底的に練習すべし。

2023年12月9日土曜日

魔法の粉 ATP

今回は「口の中に ATP 試薬とゆで卵を頬張りモグモグしていると、口の中で生卵になるかもしれない?」というお話。

A. Patel, L. Malinovska, S. Saha, J. Wang, S. Alberti, Y. Krishnan, and A. A. Hyman (2017) ATP as a biological hydrotrope. 356, 753-756. DOI: 10.1126/science.aaf6846

ミオシンは ATP を分解して筋収縮を引き起こすが ATP との相互作用の Km 値は 40 μM である。まあ薬が受容体にくっつく時の強さと比べると弱いが、生体内ではこの数十 μM の Kd 値でくっついたり離れたりを繰り返す例がよく見られる(薬とは異なり、くっついたままだと逆に悪い場合もある)。それに対して 10-100 倍モル量の ATP が細胞内(~5 mM)にはある。ATP をエネルギー源として使うのであれば、Kd 値と同じぐらいの濃度があれば、それで機能するのではないかと普通は考える。

この論文では、ATP がハイドロトロープ(Hydrotrope) であると主張されている。Hydrotrope とは、低分子量でありながら、その中に親水性と疎水性の両方の部分をもち、他の疎水的な有機化合物を水溶液中に高濃度に溶解させるような特徴をもつ物質のことである。いわゆる洗剤(界面活性剤 detergent)とは異なり、hydrotrope は疎水性部分が短いので、自発的にミセルを組むようなことはない(高濃度にすると自己会合することはあるが)。しばしば ATP のように、負電荷の親水性部分と芳香環の疎水性部分とからなる(両親媒性)。ちなみに detergent などの脂質は疎水性のしっぽの長さによって、自己集合体の形が違ってくる。界面活性剤 detergent はしっぽが短めなので、集合すると小さい球形のミセルとなる。しかし、しっぽが長くなってくると、集合体の直径も長くなり大きい球形のリポソームなどになってくる。さらに長くなると、球にはなりきれずにバイセルや細胞膜のように平面状になる。これで hydrotrope がミセルのように丸くならない理由がイメージできそうである。

著者らは、ATP が細胞内濃度である 2-8 mM に達すると、アミロイドの生成、卵の熱凝縮、液液相分離(1-25 μM FUS etc. with 8 mM ATP-Mg, APPNP-Mg)などを阻害することを示した。要するに、蛋白質どうしの相互作用を ATP が邪魔するのである。これまでは ATP-dependent な酵素のせいで凝集が解けるのだろうと思われていたが、実は hydrotrope としての機能が関与している可能性が出てきた。

塩濃度は液滴に大きな影響を与えなかった(ここでは)。液滴の中には ATP が4倍ほど濃縮されていた。加齢やミトコンドリアの酸化的リン酸化の劣化により細胞内の ATP 濃度が減ると、それにより細胞内にミスフォールドした蛋白質が凝集し、流動性が制限され、病気を引き起こす可能性がある。アルツハイマー病やパーキンソン病のような多くの神経変性疾患は老齢になってから発病するが、これは歳をとるにつれて ATP 濃度が減少するからなのかもしれない。

ATP が FUS 液滴を溶かす点については、GTP も ATP と同じぐらいの効果を示した。一方、ADP, AMP については、さらに高濃度が必要であった。やはり3リン酸の部分が親水性として機能しているためであろう。ADP, AMP, GTP などの細胞内濃度は 200-800 μM であるので、ATP ほどには大きな影響をもたらさないだろう。また、リン酸部分-Mg のみでも効果はなく、アデニン芳香環の疎水性部分が要ることが分かった。

ANS と混ぜて蛍光のシフトを観てみると、hydrotrope としての効果がわかる。そこで、ATP と古典的なハイドロトロープを比べてみた結果、ATP は疎水性分子のための可溶化微小環境を作るのに、はるかに効率的であることが示された(つまり溶けにくい油性分子の周りに、溶けやすくするための粉がまぶされているような感じ。きな粉がまぶされたワラビ餅?)。

タウリンやトレハロースのようなオスモライト(浸透圧調節物質)も蛋白質の安定性に寄与しているといわれているが、FUS 液滴を溶かす効果まではない。

細胞内の ATP 濃度が必要以上に高い理由として、ATP/ADP モル比が 50 倍ほどないと、ATP をエネルギー物質として利用するための代謝がうまく機能しないからという説がある。確かに ATP から ADP に化学変化するためには、モル比として ATP が圧倒的に多くないといけない。ATP に火を点けようとしても燃えないという事実から分かるように、ATP は特に高エネルギー物質というわけではない。しかし、例えば細胞膜を隔てて高低のモル比をつけて分離してやると、ルシャトリエの法則にみられるように、それだけでエネルギーを出せる物質となる。ならば、別に ATP でなくてもよいではないかと思われるが、実はその通りであろう。そして、分解の結果でてきた PP ピロリン酸は加水分解され、ただのリン酸となって散らばってしまうため、再びルシャトリエの法則によって、ますます ATP が ADP に変化していく。少なくともこの2点により ATP が高エネルギー物質として表彰された。

細胞内には 100 mg/mL 以上の蛋白質があり(別の文献ではもっと多い)、これらが凝集しないように保たれている。しかし、老齢化して ATP が減ると、神経変性疾患などを引き起こすのかもしれない。また、蛋白質複合体が複雑な方向に進化した際、凝集の問題が浮上した。そこで、それを防ぐための物質として、生物は DNA/RNA の一部品でもある ATP を採り入れた。おりしも ATP はエネルギー供給物質としても機能しており、後から hydrotrope として採用された可能性もある。

さて、文頭の「口の中で生卵が復活するか」という話に戻る。熱で固まった卵蛋白質(リゾチームなど)の間には、パーマの後の毛髪のように、ランダムにジスルフィド結合がかかっており、これが固茹でを実現している。よって、この S-S 結合を切るための還元剤が必要であった。ビタミン C ぐらいでは弱すぎてダメだけど、まあ冗談で苺も口に頬張ると生卵になったりして。

2023年12月8日金曜日

大腸菌培養の最少培地 M9 その6

「その5」をアップしたのが 2020 年 1 月ですので、早 4 年近く経つことになる。歳とった。。

その後に、次のような論文が出ていたらしい。

M. Cai, Y. Huang, J. Lloyd, R. Craigie, G.M. Clore (2021) A simple and cost-effective protocol for high-yield expression of deuterated and selectively isoleucine/leucine/valine methyl protonated proteins in Escherichia coli grown in shaker flasks. J. Biomol. NMR 75, 83-87. doi: 10.1007/s10858-021-00357-x

同じ著者で過去にも数報が出ており、いずれも M9 培地での培養の効率を上げる内容となっている。

この論文には、D2O を 1/10 量の 100 mL に減らしながら、これまでの 1 L 培養と同じ量のタンパク質を調製するための方法が書かれている。私も「重水 100 mL 培養は良いよ」とどこかに書いたような気もする。蛋白質を重水素化して methyl-TROSY を測ると、数 μM のような濃度でも観える。したがって、15N, 13C 安定同位体の培地を 1 L 作るのと、2H, methyl 1H/13C の培地を 0.1 L 作るのとでは、コストの面でそれほど大差はなくなってくるのである(とは言え、怖くて厳密に価格を計算していない)。それでいて、分解能は 2H 化の方が圧倒的によい。

重水 M9 培地に LB (D2O) が少しコンタミするそうであるが、3% までは 1H のコンタミの点で大したことはないそうである(本当か?)。著者らは 0.1% でも、むしろ大腸菌の成長にとって十分に効果ありと言っている(ただし、transfer cross saturation 実験に使う場合には、極力 1H の混入を避けた方がよいだろう)。

以下は論文から抜粋しているが、"100 mL" 培地に対してであることに注意

α -ketoisovaleric 32 mg
α -ketobutyric acid 16 mg
[2H]-glucose 1.8 g
[15N]-NH4Cl 0.5 g
LB (D2O) 1/1,000

グルコースの量が非常に多い。我々は 2 g/L ほど入れているが、彼らはそれの 9 倍量を入れていることになる。また、15NH4Cl も、我々は 2 g/L ほど入れるが、彼らはそれの 2.5 倍量を入れていることになる。

さらに硫黄源も多い。我々は MgSO4 の形で 2 mM ほど入れている。しかし、この論文では K2SO4 の形で 7 倍量の 14 mM も入れている。では、MgSO4 を 14 mM も入れても大丈夫なのだろうか?Mg2+ が多過ぎてダメだろうか?しかし、著者らは何故 Mg2+ の量を前回の論文での 10 mM から今回の 1 mM に減らしてしまったのだろう?我々は 2 mM 入れているが、Mg が多いと何かまずいことが起こるのだろうか?来週、学生に試してもらおう(どこかで後述)

これら、グルコース、塩化アンモニウム、硫黄源は、我々の現在の仕様より何倍も多く、これらが大腸菌の増殖に効くのだろう。さらに、微量金属やビタミンミックスもちゃんと?入れている。1/1,000 の LB 混入も効くのだろう(我々は遠心して大腸菌だけを植菌しているが)。

著者らの方法により、IPTG での誘導時の OD600 は 10 に達し、100 mL の重水培地から最終的に 11 mg の精製蛋白質がとれたそうである。確かにグルコースが通常の 10 倍近く入っている。もし、とれる蛋白質量がグルコースの絶対量に比例するならば(きっとそうだろう)、納得のいく数値である。ただし、いくつかの注意点も書かれている。

ひとつは、植え継ぎをこまめにすることである。Pre-culture を main-culture に入れて終わりというのではなく、次に植えた時に 10 倍以上は薄まらないように気をつけている(図2が分かりやすい)。こちらでも、100 mL を 1L に植えると成功するのに、20 mL を 1L に植えてしまい何度も失敗したことがある。なんと何億匹もいるはずの大腸菌が一匹残らず全滅するのである。二個目の注意点はバッフル付きの大きなフラスコを使うことである。培地の量はフラスコ容量の 1/10 以下に抑えている。これはエアレーションをよくするためであろう。ただし、上にも書いたが、実験目的が transfer cross saturation の場合には、培地の攪拌によってあまり多量の 1H 水蒸気を入れたくないので、ここが難しいところである。

著者らの方法により、たったの 100 mL で 1 L 培養と同じ量の蛋白質がとれた。もちろん、グルコースの絶対量は同じであるが、2-ケト酸や重水そのものは少なくてすむ。今、日本で重水を買うと 30 万円/L(= 2,100 USドル)であるので、かなりの節約になるだろう。