煮沸磁気共鳴

ひょんな事から、蛋白質の NMR はいったい最高何度で測られたことがあるのだろうという事実を調べることになりました。

Varnay I, Truffault V, Djuranovic S, Ursinus A, Coles M, and Kessler H. (2010) Optimized measurement temperature gives access to the solution structure of a 49 kDa homohexameric β-propeller. J. Am. Chem. Soc. 132, 15692-15698.

超好熱性古細菌（「高熱」ではなく「好熱」）由来の Ph1500 と呼ばれる蛋白質の C-末端ドメインです。この C-末端ドメインは単量体では 71 a.a. ですが、溶液中では６量体を作りますので、合計 49 kDa となります。もちろん６回回転対称性です。

温度を 80℃ にまで上げると、回転相関時間（蛋白質が１ラジアン = 57.3° 回るのに要する時間と、正確ではない定義ですが、考えることができます）が室温での 1/3 程度となり、NMR の線幅が細くなるとのことです。もちろん、高温では蛋白質分子のブラウン運動が速くなることもその一因ですが、水の粘性が下がることもおおいに影響しています。

この蛋白質は 95℃ では凝集してしまったそうです（原著では 268 K と書かれていますが、368 K の間違いでしょう。著者もいつもとは違う異常な温度に接して頭の中が混乱しているのかも）。しかし、85℃ では一週間でも大丈夫だったとのことです。

溶媒条件は以下のとおりです。
　リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）意外に高いですね。
　NaCl 250 mM（600 or 750 MHz の室温プローブを使っています。クライオプローブですと、よほどの勇気がない限り難しいでしょう。）

主鎖の帰属には [2H, 13C, 15N]-Ph1500C（単量体換算で 0.6 mM）を使いました。測定法は一連の TROSY-HNCO などです。温度は 45℃ で、帰属率は 99% です。本当は 55℃ の方が良さそうと感じたそうですが、どうもこの三重標識試料は精製が不十分であったため 50℃ で沈殿してしまったそうです。それで仕方なしに 45℃ で測定したそうです。三重標識試料は培地が高価で、さらに大腸菌での発現量が少ないので、どうしてもクロマトグラフィーではケチってサンプリングしてしまいます（溶出ピークの裾野もがばっと取り込んでしまうという意味）。そのため、非特異的に他の蛋白質などがくっ付いてきてしまい、それらが凝集を促す場合がよくあるのです。

一方、側鎖の帰属には [13C, 15N]-Ph1500C（単量体換算で 1.2 mM）を使いました。測定法は HCCH-TOCSY, HCCH-COSY などです。温度は 80℃ で、帰属率は 97% です。このようにアミド 1H が関与しない測定法では高温が効いてきます。この温度で 2D 1H-15N HSQC を測ると、少なくとも Asn, Gln の -NH2 のペアピークは全滅したそうです（溶媒によく露出しているので）。

なお、側鎖を 80℃ で帰属したので、13C-edited NOESY などもその温度で測らないといけません。そうでないと、側鎖 1H の化学シフト値がずれてしまいます。ところが、一般的に NOE の感度は高温にするとよくありません。しかし、著者らは「高温にすることによってメチル基がより完全に観えることの方が構造決定には有利である」と書いています。

一応 Xplor-NIH を使って構造を計算しています。各サブユニットは８本のβストランドからなり、４本ずつ２枚のβシート（２枚の羽根）を形成しています。６量体ですので合計 12 枚の羽根がプロペラのように並んでいます。構造計算でややこしかったのは、８本のβストランドのうち一番端の一つ（β1）だけが次の羽根に属していることです。つまり、６量体の輪のなかで循環的にドメインスワップが起こっているのです。

温度が高ければ何でもよいというわけでもありません。高温がよく効くのは、側鎖の帰属の時です。側鎖のほとんどの 1H は溶媒と交換しないためです。一方、主鎖を帰属する時には 15N-1H の TROSY を多用しますが、このアミド 1H は、高温では水の 1H と簡単に化学交換してしまいます。ここが泣き所です。この交換速度は、溶液の pH や、そのアミド基がどのぐらい溶媒に露出しているか、また隣に電荷をもった残基があるかどうかなどで変わってきますので、その中庸をとると 50℃ ぐらいがよいということになるのでしょうか？また、主鎖と側鎖の帰属用の測定でそれぞれ温度が 50, 80℃ と異なるので、両者の帰属を一致させるためには途中の温度でもいくつか測定をして、ピークの移動をたどってあげる必要もあります。

また、論文にも記載されていましたが、高温で初めて観えてくるアミド基もあります。これは室温ではちょうど intermediate-exchange mode で broad になり過ぎて観えなかったピークが、高温にすると fast-exchange mode に入って観えてきたためでしょう。

大きな蛋白質を NMR で観測するためには側鎖の 1H を 2H に重水素化することが必須の手段になってきます。ところが、そうすると 1H 間の距離情報である NOE がとれなくなります（1H はアミド基と少しの側鎖に残っているのみ）。その意味では高温でも安定でホモロジーの高い蛋白質を好熱性の種からとってきて、それを NMR で構造解析するのが一案なのかもしれません。そういえば「好熱菌まるごと一匹プロジェクト」があったように（明確な理由はいまだ不明なのですが）好熱性生物の蛋白質は安定で立体構造解析に向いている場合が多いのです。哺乳類でも超好熱性マウス（地獄温泉で泳ぐのが好きなマウス）の蛋白質がとれれば良いのですが。